实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒J亚群

将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。     

猪初情期前后瘦素长型受体Ob-Rb mRNA在垂体内表达变化的研究

[目的]观察猪初情期前后瘦素长型受体Ob-RbmRNA在垂体内的表达变化,探讨其与猪初情期发育的关系。[方法]随机选取苏姜猪120日龄、初情期、180日龄各3头,屠宰,采集垂体组织,提取垂体组织总RNA,设计引物,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测垂体内Ob-RbmRNA表达变化。[结果]在三个时期猪的垂体内都能检测到Ob-RbmRNA的表达,初情期表达量最低,与120日龄比较差异显著（P〈0.05）,与180日龄比较差异不显著（P〉0.05）。[结论]低表达量的Ob-RbmRNA有利于初情期的发生。     

牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。     

牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

[目的]为了解牛病毒性腹泻/黏膜病在新疆的流行现状,对疑似该病病料进行地方毒株的分离,并对其进行鉴定.[方法]将采自新疆不同地区疑似牛病毒性腹泻的病料接种MDBK细胞,并盲传2～4代;对分离株进行毒力测定及中和试验,应用RT-PCR方法扩增分离株的5'UTR基因片段并克隆测序分析.[结果]分离到的8 株病毒可发生细胞病变,在MDBK细胞上的TCID50为103～106.毒株血清中和实验结果,RT-PCR反应结果,克隆后重组质粒经BamH I、Hind III双酶切鉴定、重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段.重组质粒测序结果与GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒NADL株序列同源性为82.0;～94.8;.[结论]证实所分离到的病毒为BVDV,命名为B-S-1、B-S-2、B-S-3、B-S-4、B-S-5、B-S-6、B-G-1和B-G-2.     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响,以组织培养的日升番木瓜为研究对象,以β-actin基因为内参基因,应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析,建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系,研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明,0.2%的禾生素及4.0g/L和1.0g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达,而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的增殖没有抑制作用。     

低磷胁迫下茶树根系CS基因的克隆及表达分析

柠檬酸合成酶（Citrate Synthase, CS）是茶树体内合成柠檬酸的关键性酶。克隆了茶树根系柠檬酸合成酶基因片段,GenBank登录号为FJ814766,且利用半定量RT-PCR方法,研究该基因在低磷下的表达变化。结果表明,当供磷浓度为0（缺磷）时,根系CS基因的表达略有增强,这可能是茶树对低磷的一种适应机制。     

烟草病毒检测技术研究进展

近年来烟草病毒病发生病普遍,且日趋严重,对烟草的产量及质量影响很大,使烟草行业蒙受巨大损失。鉴于此,建立有效的病毒检测技术,对烟草病毒进行防治十分重要。综述了国内外对烟草病毒的检测技术,主要包括:指示植物法、电镜检测方法、血清学方法、分子生物学方法等。     

浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒

采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),对杭州、嘉兴、绍兴3市6县(市、区)的果树园林植物进行李属坏死环斑病毒病的病情调查,采集检测样品包括樱桃、桃、李、杏和月季等12种寄主植物共计102个.结果表明,10个海宁月季样品的ELISA结果呈阳性,其他样品呈阴性;阳性样品经RT-PCR检测和CP基因测序验证,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒.     

柑桔木质陷孔病类病毒贵州分离物的分子鉴定

 从采自贵州感染了啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）的柑桔植株中抽提总核酸,通过一对鉴别引物,经RT-PCR扩增初步筛选出柑桔木质陷孔病类病毒（Citrus cachexia viroid, CCaVd）。扩增该类病毒的全长核苷酸片段,通过克隆和测序,结果发现,该片段全长298bp,与GenBank中报道的木质陷孔病类病毒分离物同源性达到96％以上。这是中国发生的木质陷孔病类病毒的分子生物学特征的首次报道。     

维生素A对视黄素X受体β基因的诱导表达研究

采用RT-PCR技术检测分析了不同浓度的维生素A在猪的成纤维细胞内分别作用12、24和48 h后,视黄素X受体β基因（RXRβ）的表达变化情况。结果表明：不同浓度的维生素A对RXRβ基因的作用效果不同,12 h时,30.0μg·μL^-1组可显著诱导RXRβ基因的表达,24 h时,10.0μg·μL^-1组可显著诱导RXRβ基因的表达,48 h时,各组与对照组之间不存在差异。